Entwicklung und Anwendung genetisch kodierter molekularer \(\it {toolkits}\) zur Untersuchung der Regulation von Ionenkanälen durch Phosphoinositide

  • Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP\(_{2}\)) und Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP\(_{3}\)) sind bedeutende Signalmoleküle in der Plasmamembran, die unter anderem direkt an der Regulation der meisten Ionenkanalspezies beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden molekulare \(\it {toolkits}\) zur Untersuchung dieser Regulation entwickelt. Zur Messung von Veränderungen der Phosphoinositidkonzentrationen wurden FRET-Sensoren verwendet und zur Depletion von PIP\(_{2}\) und PIP\(_{3}\) wurde die spannungsgesteuerte Phosphatase von \(\textit {Ciona intestinalis}\) (CiVSP) eingesetzt. Selbst-spaltende virale 2A-Peptide wurden zur multicistronischen adenoviralen Expression von CiVSP und den FRET-Sensoren aus einem Leserahmen genutzt. Diese \(\it {toolkits}\) erlaubten die simultane Manipulation und Messung von PIP\(_{2}\) oder PIP\(_{3}\) in intakten Zellen bei gleichzeitiger Registrierung von Ionenströmen. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen die vielseitige Anwendbarkeit der \(\it {toolkits}\) in Zelllinien und terminal differenzierten Zellen.
  • Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP\(_{2}\)) and phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP\(_{3}\)) are key signal molecules in the plasma membrane involved in direct regulation of the majority of ion channel species. The aim of this work was to design and apply molecular toolkits for investigating this regulation. FRET sensors were used to monitor changes in phosphoinositide levels and \(\textit {Ciona intestinalis}\) VSP (CiVSP) was applied for controlled depletion of PIP\(_{2}\) and PIP\(_{3}\). Self-cleaving viral 2A peptides were used to allow multicistronic adenovirus-driven expression of CiVSP and FRET sensors from a single open reading frame. Transfection of cells with the toolkit vectors permitted simultaneous manipulation and monitoring of PIP\(_{2}\) or PIP\(_{3}\) while performing whole-cell patch clamp recordings. The data demonstrate versatility of the developed toolkits for investigation of regulation of ion channels by phosphoinositides in cell lines and terminally differentiated cells.

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Metadaten
Author:Fabian HertelGND
URN:urn:nbn:de:hbz:294-34272
Referee:Lutz PottORCiDGND, Michael HollmannORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/05/11
Date of first Publication:2012/05/11
Publishing Institution:Ruhr-Universität Bochum, Universitätsbibliothek
Granting Institution:Ruhr-Universität Bochum, Fakultät für Chemie und Biochemie
Date of final exam:2012/03/30
Creating Corporation:Fakultät für Chemie und Biochemie
GND-Keyword:Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer; Kaliumkanal; Phospholipide; PH-Domäne; Kaliumstrom
Institutes/Facilities:Institut für Physiologie, Abteilung für Zelluläre Physiologie
Dewey Decimal Classification:Naturwissenschaften und Mathematik / Chemie, Kristallographie, Mineralogie
faculties:Fakultät für Chemie und Biochemie
Licence (German):License LogoKeine Creative Commons Lizenz - es gelten der Veröffentlichungsvertrag und das deutsche Urheberrecht